1.引物(wù)最好在模闆 cDNA 的(de)保守區(qū)内設計，保守區(qū)是不同物(wù)種同一基因的(de)相同序列DNA 序列。

2.引物(wù)長(cháng)度一般在15 ～ 30bp之間。引物(wù)長(cháng)度常用(yòng)的(de)是18 ～ 27bp，過長(cháng)會導緻其延伸溫度大(dà)于74℃，不利于PCR反應。

3.引物(wù) GC 含量在40%~60％之 間，Tm 值最好接近68 ～ 72 ℃， GC含量過高(gāo)或過低都不利于反應起始。上下(xià)遊引物(wù)的(de)GC含量不能相差太大(dà)。Tm值計算(suàn)方法可(kě)參考公式Tm=4 (G+C)+2 (A+T)  。

4.引物(wù)3’端要避開密碼子的(de)第3位。如擴增編碼區(qū)域，引物(wù)3’端最後一個(gè)堿基不能是密碼子的(de)第3位，因密碼子的(de)第3位易發生簡并，會影(yǐng)響擴增的(de)特異性與效率。

5.引物(wù)3’端一般不建議(yì)選擇A。當末端堿基爲A時(shí)，引發錯配的(de)概率增加。

6.堿基要随機分(fēn)布。引物(wù)中四種堿基的(de)分(fēn)布最好是随機的(de)，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的(de)存在，像CCC或GGG，否則容易導緻錯誤引發。

7.引物(wù)自身及引物(wù)之間不應存在互補序列。引物(wù)自身存在互補序列，容易形成發夾結構。兩引物(wù)之間也(yě)不應具有互補性，以防止引物(wù)二聚體的(de)形成。

引物(wù)二聚體及發夾結構如果不可(kě)避免的(de)話(huà)，應盡量使其△G值不要過高(gāo)。二聚體的(de)形成會降低引物(wù)有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

8.引物(wù)5’端和(hé)中間△G值應該相對(duì)較高(gāo)，而3’端△G值較低。△G值可(kě)以反映雙鏈結構内部堿基對(duì)的(de)相對(duì)穩定性，△G值越大(dà)，則雙鏈越穩定。應當選用(yòng)5’端和(hé)中間△G值相對(duì)較高(gāo)，而3’端△G值較低的(de)引物(wù)。

9.引物(wù)的(de)5’端可(kě)以修飾，而3’端不可(kě)修飾。擴增是由3’端開始的(de)，不能進行修飾，而引物(wù)的(de)5’端不影(yǐng)響PCR擴增的(de)特異性,所以可(kě)以進行修飾。

10.擴增産物(wù)的(de)單鏈不能形成二級結構。在選擇引物(wù)位置時(shí)，最好避開二級結構區(qū)域。

11.引物(wù)應具有特異性。引物(wù)設計完成以後，應對(duì)其進行BLAST比對(duì)，不應與其它基因互補。